线粒体关联膜（MAMs）是已知的退换细胞器和细胞功能，并可影响病理生理学，包括心肌缺血再肃肃（IR）毁伤。因此，细则MAMs中退换IR毁伤扫尾的分子靶点将成为灵验诊疗的重要。在这里，咱们发现氯离子胞内通谈卵白（CLIC4）存在于心肌细胞的mam中，并解释其在生理和病理条目下退换内质网和线粒体钙稳态的作用。在小鼠模子中，缺血再肃肃毁伤后，CLIC4的丢失增多了心肌梗死并权贵责怪了心功能。与野生型心肌细胞比较，CLIC4缺失心肌细胞在缺氧-复氧毁伤时出现凋一火增多和线粒体功能阻挠。总的来说，咱们的扫尾标明MAM-CLIC4是细胞对IR毁伤响应的一个重要介质，因此可能对其他病理生理经过有潜在的影响。
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简介越来越多的根据标明线粒体关联膜（MAMs）参与退换多样细胞经过，并充任活性氧（ROS）和钙（Ca）的信号纳米区二+) (1，2)在内质网和线粒体之间。MAM卵白功能的任何失调都会阻扰ER-线粒体的耦合和通信，并导致包括肿瘤变成、炎症和神经系统零乱在内的不良响应(1).因此，卤莽MAM卵白并细则其信号机制将为一些东谈主类疾病的先前未细则的药理诊疗靶点奠定基础。细胞内离子通谈通过守护离子内稳态来退换细胞器内的通信，是决定细胞运谈的主要身分(三).天然阳离子通谈在MAMs中是有特色的(4)，氯（Cl）的分子归拢性和功能关联性?)对频谈的了解未几。细胞内氯离子通谈（CLIC）卵白是细胞内氯离子通谈（CLIC）的伏击构成部分，具有退换吞吃体酸化、细胞周期退换、血管生成和细胞凋一火等多种生理功能，并与东谈主类疾病磋商(5，6).六种哺乳动物的CLIC1到CLIC6都不错以可溶性和完竣膜的体式存在，并存在于不同的细胞器膜中，但它们在MAM中的存在尚不解确(7).重要的悬而未决的问题仍然是可溶性的CLICs若何插入到膜中变奏凯能性离子通谈。
CLICs有助于腹黑保护，因为阻断CLIC会增多心肌梗死（MI）(8)缺血再肃肃（IR）毁伤与缺血预惩办（IPC）的腹黑保护作用(9).吲哚氧乙酸（IAA-94）手脚一种CLIC遏制剂，能阻断CLIC卵白的通盘反作用，其在崇尚MI中的着实作用和机制偏执在心力衰败（HF）中的伏击性尚不清亮。咱们的磋商强调了CLIC4在MAMs中的存在，以及MAM特异性CLIC4在ER线粒体Ca中的作用和机制二+通过退换线粒体生理学来保护腹黑免受IR毁伤。咱们不雅察到心衰患者和健康腹黑细胞器膜组分中CLIC4在细胞质中的分散各异。因为CLIC4在介导多种细胞经过中至极伏击(5，6)，咱们的发现揭示了氯化锰通谈退换多种病理生理条目的机制。
扫尾CLIC4是一个主要的Cl?通谈在小鼠成年心肌细胞中，咱们不雅察了CLIC4在线粒体细胞器标志物（MitoTracker）、线粒体外膜（OMM）和MAM中的定位和分散(1)，以及酰基辅酶A（CoA）合成酶长链家眷成员4（ACSL4）（MAM）(10) (图1，A和B).CLIC4与线粒体的共定位率较高（41.2±0.6%），n=40个细胞）和内质网-线粒体战争部位卵白mitofusin 2和ACSL4（34±1%和31±2%，n=25个细胞）。CLIC4在分离的粗线粒体（58±10%）和重生心肌细胞（40±4%）中抒发，n=28）也自满了与有丝分裂追踪器加载的线粒体的关联（图S1），但CLIC1（CLIC4的一个分支）自满与原始线粒体的共定位性较低（39±8%，P=0.03）或重生儿心肌细胞（29±3%，P=0.03，n=28）与CLIC4（图S1）比较。为了设置CLIC4在心肌细胞中的缜密则位，咱们用30%Percoll梯度离心法纯化线粒体(11)并不雅察到，与GRP78（ER/MAM标志）相似，CLIC4在超纯M3馏分中的存在不错忽略不计(图1，C和D) (12).超纯线粒体中CLIC4的缺失以及它们与有丝分裂追踪器负荷心肌细胞的高度共定位促使咱们评估它们在MAMs中的存在。Western-blot分析偏执定量分析标明CLIC4优先分散于MAM而不是超纯的线粒体部分，从而细则CLIC4是MAM特异性的Cl?渠谈(图1、E和F).
图1CLIC4的生化脾气。
(A)小鼠成年心肌细胞的代表性图像自满CLIC4与线粒体（第1行）、ACSL4（第2行）和线粒体2（第3行）共定位。(B)自满共域化量化的条形图。数据用mean±SEM示意；N=4拒绝；n≥25(C)具有代表性的Western印迹自满超纯线粒体（M3）的分馏弧线，标明M3组分中不存在CLIC4和GRP78，但在M3组分中存在ATP合成酶。(D)用胭脂红S染色法测定不同亚细胞组分中CLIC4、GRP78和ATP合酶尺度化为总卵白的百分比抒发。(E)具有代表性的MAM分离的Western印迹标明，在MAM中存在CLIC4，而在纯化的线粒体中莫得。(F)用丽春红S染色法测定不同亚细胞组分中CLIC4和GRP78的抒发百分比，并与总卵白含量进行比较。（D）和（F）中的图表描画了卵白质尺度化抒发百分比的平均值±SEM；N=3*P≤0.05，学生的t测试。(G)转染CLIC4全长标志的HEK细胞（第1行），CLIC4?C189（第2排）和CLIC4?Q67（第3行）装载有丝分裂追踪器、抗旗号抗体和抗遏制抗体，并与DAPI共染色，自满通盘CLIC结构物与线粒体共定位（Merge）。
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在稽查器中大开咱们还磋商了与mam靶向关联的CLIC4域。咱们用全长CLIC4，CLIC4-ΔC189和保留N-末端和跨膜结构域（TMD）的CLIC4-ΔC189的N-末端标志结构转染东谈主胚肾（HEK）细胞(13).咱们的扫尾标明，每个转染的CLIC4构建了与HEK细胞有丝分裂追踪器共定位的结构(图1G)这标明，TMD完竣的N端认真其对MAMs的靶向和定位。
MAM-CLIC4退换Ca二+均衡MAM是Ca的磋商站点二+内质网和线粒体之间的ROS信号(1，2，14).了解MAM-CLIC4在Ca中的作用二+通过信号转导，咱们将野生型（wt）和客户4?/?幼犬[出死后第3天（p3）]捎带腺病毒编码细胞器靶向Ca二+传感器G-CEPIA1er(15)[ER/肌浆网（SR）；图2A]和mtRCamp1h(16)线粒体；图2D)测量SR和线粒体Ca前48～72小时二+差异转换。测量SR-Ca二+泄漏，加利福尼亚州二+通过SR/ER-Ca摄取二+-腺苷三磷酸酶（SERCa2a）被thapsigargin阻断，G-cepiaer荧光衰减时分常数手脚SR-Ca的指令剂二+泄漏。G-cepiaer荧光衰减的时分常数相对较快客户4?/?与wt-MNCMs比较，标明SR-Ca加快二+泄漏客户4?/?心肌细胞(图2、B和C).此外，咱们还不雅察到线粒体Ca增多二+在里面客户4?/?MNCMs公司(图2，E和F)与wt比较，mtRCamp1h荧光增强。线粒体Ca增多二+在里面客户4?/?在线粒体单一钙离子（MCU）、遏制剂Ru360存鄙人，MNCMs收复平淡(图2，E和F) (17).更快的SR Ca二+渗漏和线粒体钙增多二+水平标明SR和线粒体Ca有舛误二+内稳态客户4?/?MNCMs公司。加利福尼亚州二+家喻户晓，线粒体超载会触发线粒体通透性转机孔（mPTP）的怒放，导致细胞示寂(18).因此，咱们测量了钙二+保留容量（CRC）（单元：wt）和客户4?/?心肌线粒体。CRC是线粒体保留Ca的智力二+在矩阵中直到达到阈值水平，最终导致mPTP大开。浅易地说，非常的线粒体二+被标志为Ca二+绿色-5N，用CaCl法测定CRC2脉冲。客户4?/?与野生型心肌线粒体比较，心肌线粒体的CRC减少（~17%，P=0.01，n>11）意味着mPTP的早期怒放(图2，G和H)增多了对压力的敏锐性。相悖，ER特异性CLIC1的缺失(19)与wt心肌线粒体相似(图2，G和H)标明MAM定位的CLIC4而不是ER关联的CLIC1在退换mPTP怒放中的特殊作用。MCU和mPTP退换卵白亲环素D的抒发（图S2，A和B）(8)在客户4?/?以及腹黑组织。环孢霉素A（CsA）((8)亲环素D的遏制剂能增强wt（~2倍）和客户4?/?（约2倍）心肌线粒体与相应载体对照组比较。关联词，CRC客户4?/?CsA组心肌线粒体（93±7.3%）昭着低于CsA组（130±7.6%），P=0.025，n=3）（图S2、C和D）。
图2CLIC4的功能脾气。
(A)腺病毒感染SR-Ca内G-CEPIA1er后72小时培养的MNCMs的代表性图像二+生物传感器。(B)代表性时变弧线(F/F0)感染MNCMs的G-cepiaer荧光。记载2min后，将心肌细胞表露于SERCA遏制剂thapsigargin（THAPS；10μM），策画衰减时分常数（τ，s）手脚SR-Ca的测量值二+泄漏。信号尺度化为应用高剂量咖啡因（10毫米）取得的最小荧光。(C)该图刻画了基线G-cepiaer荧光的平均数据±SEM(F/F0)和tau（s）。N=3 wt拒绝，N=4个客户4?/?拒绝，n14厘米重，n=33客户4?/?MNCMs公司*P<0.05，学生t测试。(D)腺病毒感染mtRCamp1h基质Ca 72小时后培养的MNCMs的代表性图像二+生物传感器。(E)有代表性的踪影二+]米（μM）分量和客户4?/?MNCMs，以及客户4?/?MNCMs用Ru360（1μM）预孵育10分钟。记载5分钟后，MNCMs在EGTA（2mm）惩办前进行皂甙浸透（SAP），以取得最小的荧光，然后用Ca二+（20μM）取得最大荧光强度。(F)该图刻画了[Ca]的平均数据±SEM二+]米（μM）。N=3个wt拒绝，N=3个拒绝客户4?/?，n=18 wt MNCMs，以及n=11客户4?/?MNCMs公司*P<0.05，学生t测试。(G)线粒体外钙二+用Ca标志二+Green-5N与Ca的接收二+单元为分量，客户4?/?，和clic1?/?心肌线粒体，添加5μM CaCl2脉冲。当Ca达到最大阈值时，mPTP激活二+到达线粒体内。(H)示意CaCl平均脉冲量化的条形图2mPTP大开需要。加利福尼亚州二+mPTP启齿所需的数值示意为平均值±SEM；N=12分量，N=4个clic1?/?，和N=15客户4?/?; *P<0.05，学生t测试。
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在稽查器中大开接下来，咱们评估了线粒体和细胞质Ca的变化二+同期磋商咖啡因对线粒体Ca的率领作用二+移动分量与客户4?/?心肌细胞。测定线粒体Ca二+用抒发mtRCamp1h的腺病毒和胞浆Ca转染MNCMs二+使用Fluo-3 AM进行测量。用咖啡因率领RyR2介导的Ca二+心肌细胞开释。如所示图3（A和B），咱们不雅察到细胞内咖啡因瞬时振幅权贵责怪客户4?/?心肌细胞与wt心肌细胞比较，标明SR-Ca增多二+泄漏客户4?/?心肌细胞由于RyR2通谈过度活跃。线粒体咖啡因瞬时波幅在wt和客户4?/?心肌细胞对咖啡因的率领，标明更灵验的钙二+下胞浆移动二+]可在这些心肌细胞中摄取(图3、C和D).总之，咱们的扫尾证据了MAM-CLIC4在守护Ca中的伏击性二+ER/SR线粒体界面的稳态。
图3.CLIC4影响ER/SR线粒体Ca二+移动。
(A)氟-3荧光(F/F0)wt和客户4?/?胞质钙二+由高剂量咖啡因引起的霎时性。(B)Ca的平均数据±SEM二+瞬态振幅。n=12个客户4?/?细胞，n=17 wt电板，以及N=每组3次拒绝。(C)咖啡因率领Ca的mtRCamp1h荧光谱二+瞬态，带图形(D)代表平均值±SEM。n=17 wt电板，n=12个客户4?/?细胞，和N=每组3次拒绝（与I和II相易的细胞）*P<0.05，学生t测试。
在稽查器中大开咱们还评估了CLIC4在胞浆Ca中的作用二+惩办。成年wt和客户4?/?心肌细胞负载Fluo-3am和胞浆Ca二+通过0.5hz起搏诱发瞬态，并记载有无β-肾上腺素能受体刺激时使用异丙肾上腺素（ISO）（100nm）记载。Ca无变化二+SERCa2a Ca的瞬时振幅、峰值时分和速度二+-wt中存在和不存在ISO时的介导摄取客户4?/?心肌细胞（图S3，A到H）。实验实当前，加入咖啡因来测量SR-Ca二+本色。咱们莫得不雅察到咖啡因瞬时振幅在存在和不存在时在wt和ISO中的变化客户4?/?心肌细胞。胞质钙二+用Fura-2AM染色检测有无ISO时的变化(20).在条约中，咱们莫得不雅察到Ca的任何变化二+瞬态振幅（Δ340/380）in客户4?/?心肌细胞，标明胞浆Ca莫得变化二+瞬态（图S3、I和J）。因此，咱们的磋商强调，穷乏CLIC4并不及以克服Ca的自我退换智力二+转换细胞质Ca的搬运机械二+成年心肌细胞的轮回（图S3，A到J）。
消融CLIC4可增强缺血再肃肃毁伤后的心肌梗死钙退换失调二+心肌细胞的稳态与心衰和心肌梗死磋商(21，22).此外，阻断Cl?通谈，包括CLIC4，在IR毁伤时使用IAA-94增强MI(8)崇尚IPC的腹黑保护作用(9).为了细则CLIC4的病理生理作用，咱们比较了年事匹配的wt和客户4?/?小鼠左冠状动脉主降支结扎术(23).CLIC4的缺失昭着加剧了梗死边界（43±3%，N=5，P=0.03），与野生型小鼠比较（28±3%，N=5）经伊文念念蓝和2，3，5-三苯基四氮唑（TTC）双染色腹黑切片评估(图4，A和B).在通盘组中，由危急面积（AAR）界说的可能缺血区域在通盘组中都是相似的(图4C).结扎后，clic1?/?小鼠的心肌梗死面积与野生型腹黑相似（图S4，A到C），强调CLIC4，而不是CLIC1，参与腹黑缺血事件的腹黑保护。正如预期的那样，与假手术比较，IR毁伤后两组小鼠的血浆肌钙卵白水平均升高（图S4F）。超声心动图分析(图4，D至F) (24，25)左室射血分数（LVEF）和左室短缩分数（LVFS）无各异客户4?/?和野生型小鼠，差异在24小时的假手术后。关联词，在IR组，客户4?/?与wt腹黑比较，腹黑前壁领略受损且无领略(图4D以及电影S1到S4）。缺血再肃肃毁伤后，左室射血分数和左室功能收复平淡客户4?/?扫尾为44±6%(图4E)和22±3%(图4F)LVEF差异为32±3%和4%(N=每个分量为5客户4?/?差异为）。左心室功能昭着责怪客户4?/?与wt小鼠比较，IR毁伤后小鼠的CLIC4抒发对守护腹黑功能至关伏击(P=0.02，N=5）。相悖地，clic1?/?小鼠在IR毁伤后发达出与wt小鼠相似的LVEF和LVFS（图S4、D和E）。
图4.CLIC4用于保护腹黑免受IR毁伤。
(A)结扎40分钟再肃肃24小时的小鼠心肌梗死增多客户4?/?与wt.假手术对照组比较，小鼠未出现任何梗死。(B)示意梗死面积的图形，尺度化为AAR。(C)不同实验组的AAR相似。(D)代表性M型超声心动图客户4?/?左心室经过24小时的假手术和IR手术。两个LVEF(E)和分数裁减(F)在客户4?/?IR毁伤后小鼠与wt小鼠比较。(G)TTC染色的wt和客户4?/?基于Langendorff的体外IR毁伤后腹黑梗死增多客户4?/?心。(H)假红外和离体IR毁伤后梗死的定量分析。(我)缺血25min后，在再肃肃前用IAA-94/DMSO灌流10min客户4?/?老鼠。TTC染色的代表性腹黑切片自满，IAA-94存在时，wt腹黑的梗死昭着增多，但这种增多在IAA-94中莫得不雅察到客户4?/?心。(J)在wt和不存在IAA-94的情况下，梗死面积的量化客户4?/?心。(K)wt和客户4?/?离体缺血再肃肃毁伤后的心肌线粒体。(我)示意CaCl平均脉冲量化的条形图2mPTP开启所需的客户4?/?心肌线粒体毁伤。数据刻画为平均值±SEM；N=每个实验组5个*P<0.05，学生t测试。
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在稽查器中大开咱们还磋商了腹黑CLIC4在体外IR毁伤模子中的作用(12).与体内红外毁伤模子所得扫尾一致(图4，A至F)，咱们不雅察到心肌梗死的进度权贵增多客户4?/?腹黑与wt比较（56±7%对38±4%，P=0.02，N=5）由TTC染色细则(图4，G和H).假放肆客户4?/?wt小鼠腹黑也出现了访佛进度的梗死（约18%，N=每个5个）。与溶媒对照品[二甲基亚砜（DMSO）]比较，IAA-94增多了wt小鼠的MI（37±1%对63±7%，P≤0.05，N=5）(图4，I和J)但不是在客户4?/?腹黑（61±5%对46±10%，N=5）体外IR毁伤后，指示CLIC4是IAA-94在腹黑中的一个特定靶点。此外，在离体IR毁伤后，Ca二+mPTP大开所需客户4?/?心肌线粒体（37.5±1.3%）昭着低于野生型（53.8±2.1%），P=0.001，N=4）(图4，K和L).这证据了CLIC4的缺失增多了MI-in客户4?/?小鼠线粒体Ca的退换二+如前所示(图2).咱们的磋商扫尾提供了素养根据，以为腹黑CLIC4是保护腹黑免受缺血毁伤的一个新扮装，亦然IAA-94介导的腹黑无益作用的重要靶点。
HF与离子通谈抒发、分散和功能的变化磋商(26，27).肺动脉高压患者肺组织中CLIC4抒发增强(28)风湿性腹黑瓣膜病患者(29).咱们探讨了在8周的持久性LCA结扎小鼠腹黑和心衰患者腹黑切片中CLIC4的抒发变化。慢性心肌毁伤小鼠腹黑切片自满CLIC4抒发增多(P<0.01，N=4）相干于假手术小鼠（图S5，A和B）。与平淡腹黑比较，心衰患者的腹黑切片中也不雅察到CLIC4的这种增强抒发（图S5、C和D）。家喻户晓，clic会在压力下转换它们的分散(30，31)，咱们试图细则CLIC4和CLIC1在衰败和非衰败腹黑中的分散。如图S5（E和F）所示，尽管不权贵，但在细胞溶胶中不雅察到CLIC4相干于细胞器组分的分散增多(32)在失败的心与莫得病的心比较。关联词，未不雅察到CLIC1的分散变化。这标明，在心衰中，细胞器膜部分CLIC4的插入减少会影响其离子通谈功能，从而在腹黑保护中起重要作用。
心肌细胞CLIC4参与细胞保护咱们还磋商了CLIC4在细胞水平上独处于其他心肌细胞环境的心肌保护作用。客户4?/?在缺氧-复氧（HR）毁伤6小时/12小时后，与wt比较，MNCMs的细胞示寂增多（24±8%对4±0.4%，P<0.05，N=3）通过增多TUNEL（末端脱氧核苷酸移动酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标志）阳性细胞检测到(图5，A和B) (33)指示CLIC4在决安定肌细胞对HR毁伤的响应中起作用。线粒体膜电位(?Ψ米)是决定细胞活力的重要身分(34).牺牲?Ψ米在mPTP时，怒放性不错率领MI(34).因为在客户4?/?心肌线粒体，咱们测量了?Ψ米在wt和客户4?/?电位染料JC1用于HR毁伤后MNCMs的磋商(33).客户4?/?MNCMs发达为?Ψ米，与平淡氧比较增多26±5%(P≤0.05，N=4，n=500个细胞），而wt自满Ψ米牺牲仅为7±2%，标明CLIC4在守护?Ψ米(图5，C和E).线粒体ROS生成和Ca增多二+超负荷是mPTP怒放导致细胞示寂的主要身分(18).客户4?/?与平淡氧比较，HR毁伤后的MNCMs活性氧生成权贵增多（1.4±0.1倍，N=4，n=500个细胞），而wt仅自满1.1±0.04倍的增多(图5、D和F).这些扫尾强调了CLIC4通过退换ROS和mPTP的怒放在HR毁伤中介导细胞保护的伏击作用。
图5CLIC4通过退换线粒体膜电位和ROS水平介导细胞免受HR毁伤的保护。
(A)从wt和客户4?/?幼犬接受6小时缺氧和12小时复氧。细胞固定，TUNEL阳性核（红色）和细胞核（蓝色）染色。箭头示意TUNEL阳性细胞。(B)TUNEL阳性细胞的定量。数据用TUNEL阳性细胞平均值±SEM示意。N=3个拒绝，n=wt和客户4?/?心肌细胞*P<0.05，领受光棍分方差分析（ANOVA）磨练和Newman-Keuls过后分析。(C)分离自wt和MNCMs的JC1摄取共聚焦图像客户4?/?p3幼崽，遇到HR毁伤，在平淡氧条目下培养。(D)H2DCFDA染色wt和客户4?/?HR毁伤后的MNCMs并在常氧条目下培养。(E)柱状图自满线粒体膜电位牺牲相干于平淡氧的增多客户4?/?HR毁伤后心肌细胞与wt-MNCMs的比较。数据用线粒体膜电位牺牲百分比平均值±SEM示意。N=4个拒绝和n=500个电板，wt和客户4?/?心肌细胞*P<0.05，用Newman-Keuls过后分析进行光棍分方差分析。(F)条形图自满ROS生成量相干于平淡氧的增多客户4?/?MNCMs与wt比较。所非凡据均以平均值±SEM示意；N=4个拒绝，n=500个电板，wt和客户4?/?心肌细胞*P<0.05，用Newman-Keuls过后分析进行光棍分方差分析。
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在稽查器中大开商讨在这里，咱们把CLIC4设置为一个新颖的Cl?在姆妈那处的频谈。在MAMs中卤莽出1212种卵白质，其中1000种在大脑和肝脏中被卤莽(4，35，36).这些卵白质中的一些是离子通谈，被以为对钙的退换很伏击二+内质网与线粒体的稳态(4).由于离子通谈在决定细胞和细胞器的结构和功能完竣性方面起着至关伏击的作用，因此它们的严立场控功能关于介导内质网-线粒体通信至关伏击。除SERCA2a和RyR2外，钠（Na+)钾（K+)通谈也在MAMs中酬劳(4).关联词，一样伏击的Cl?腹黑MAM中的通谈偏执在退换MAM功能中的潜在作用尚未被破译。在这项磋商中，咱们系统地揭示了细胞内Cl的存在?通谈卵白，CLIC4，存在于心肌中，而不存在于线粒体中。此外，咱们细则了完竣的TMD的N端区域关于保握MAMs的定位是必要的和弥散的。CLIC4（也称为p64H1、mtCLIC和HuH1）在线粒体平分散(19，37，38)还有呃(39)在细胞应激条目下，它不错移动到细胞核(31).咱们的扫尾进一步证据了CLIC4在小鼠心肌细胞中的各异分散。
CLIC4在妈咪体内的发现促使咱们磋商其生理作用。内质网与线粒体的距离在10～25nm之间(40)因此，它们在空间和功能上耦合在全部也就不及为奇了。ER-线粒体互相作用与ROS和Ca磋商二+他们之间的运载(41，42).咱们不雅察到二+无CLIC4时心肌细胞开释，标明SR-Ca二+泄漏。这标明CLIC4可能对Ca有退换作用二+发布渠谈，如IP3R和RyR2s(43).往时的磋商标明，RyR2s的活性不错通过SR中不雅察到的阴离子梯度来退换(44).另一个CLIC家眷成员，CLIC2，在小鼠中不存在(7)，通过率领骨骼肌RyR1的构象变化来退换其怒放概率，从而退换其活性(45).与这些扫尾相似，咱们解释了CLIC4在退换小鼠心肌细胞中RyR2活性的作用。因此，磋商CLIC4退换RyR2活性的机制是很有有趣的。
咱们还不雅察到基底线粒体Ca增强二+重生儿客户4?/?心肌细胞。此外，这增多了线粒体基底Ca二+可能是导致CRC减少的原因客户4?/?心肌线粒体。关联词，在客户4?/?腹黑，咱们莫得不雅察到MCU的抒发有任何变化，MCU是一种认真Ca的卵白质二+线粒体在内质网线粒体微区的摄取(46).关联词，MCU存在翻译后修饰的可能性，如半胱氨酸氧化(47)或增强酪氨酸磷酸化(48)这是家喻户晓的增多MCU的活性。早些时候，有根据标明CsA不成援手由CLIC阻断剂IAA-94仲裁的减少的CRC(8).咱们的扫尾标明，CsA不错援手在客户4?/?心肌线粒体，但进度与wt不同。这标明心肌线粒体中存在IAA-94的另一个靶点，该靶点与CLIC4取悦退换CsA或客户4?/?心肌线粒体一经超载钙二+阈值水平比wt早得多。
另外，咱们在咖啡因率领线粒体Ca的ER/SR的磋商中发现二+移动自满钙的快速开释二+从SR到RyR2活化伴跟着钙的快速积存二+在线粒体中，指示CLIC4可能是ER/SR线粒体Ca的退换剂二+移动。咱们莫得不雅察到胞质Ca的变化二+有/无ISO时记载的瞬态客户4?/?小鼠成体心肌细胞与野生型心肌细胞比较，指示CLIC4的缺失不会严重影响细胞质Ca二+但可能会增多Ca的速度二+生理条目下内质网线粒体结构域的内流。线粒体平直有趣的磋商二+均衡。
家喻户晓，内质网线粒体通信失调会转换腹黑生理，并与腹黑缺血再肃肃毁伤密切关联(49).往时的磋商也标明阻断Cl?IAA-94通谈阻断缺血/药物预惩办介导的腹黑保护作用(9，50)和CsA(51)以及导致mPTP早期怒放(8).在本磋商中，咱们解释客户4?/?与野生型小鼠比较，接受体内或体外IR毁伤现实的小鼠腹黑自满心肌梗死增强，左心室功能受损。此外，咱们不雅察到在客户4?/?小鼠与野生型小鼠心肌线粒体在离体IR毁伤中的比较。这标明Ca增多了二+基本条目下的水平客户4?/?心肌细胞可能在应激性刺激如IR毁伤时导致mPTP早期怒放。访佛于其他酬劳(8，9，50)，经IAA-94预惩办的wt腹黑心肌梗死昭着增多，但未不雅察到这种变化客户4?/?心。此外，在IAA-94存在的情况下，wt腹黑发达出访佛的梗死到clic4?/?腹黑受载具放肆，抹杀了其他CLICs在腹黑保护中免受IR毁伤的可能性。因此，IAA-94对腹黑的无益作用是通过靶向CLIC4介导的。早期的CLIC1存在于细胞内的细胞器，如ER、溶酶体和细胞核中(7).在心肌细胞中，CLIC1定位于ER(19);关联词，CLIC1缺失突变小鼠在IR毁伤后的MI莫得发达出各异，标明ER-CLIC1守护的阴离子梯度不影响细胞对毁伤的响应。总而言之，咱们不错令东谈主服气地将CLIC4的腹黑保护作用归因于通过退换线粒体生理来驻扎IR毁伤。在遇到慢性心肌毁伤（8周LCA）的衰败东谈主类腹黑和小鼠腹黑中，不雅察到心肌切片中CLIC4的抒发增强。咱们进一步对腹黑组织进行了亚组分(32)与健康对照组比较，在衰败的东谈主腹黑中，与细胞器膜组分关联的CLIC4抒发增强。敬爱的是，CLIC1在心衰腹黑组织中的分散莫得任何各异。心衰时可溶性CLIC4内化到细胞器膜的进度较低，这可能导致其细胞内膜部分（如MAM）功能活性下落，并可能导致心力衰败时期的病理扫尾，在心衰时期，CLIC4在亚细胞组分平分散变化的机制需要敷陈，才能皆备领路其作用。
遏制CLIC4可率领东谈主头颈部鳞癌细胞株（HN4）凋一火，引起线粒体膜去极化(52).在这里，咱们找到了客户4?/?与野生型心肌细胞比较，HR毁伤后心肌细胞凋一火增多，线粒体膜去极化增多。两种钙都增多了二+超负荷和ROS的产生导致mPTP的变成和怒放导致细胞示寂(53).HR受伤后，客户4?/?与wt心肌细胞比较，心肌细胞的ROS生成增多，这标明，除了Ca增多外二+在中不雅察到过载客户4?/?小鼠腹黑再肃肃时ROS生成增多可能是线粒体膜去极化和细胞示寂的原因。咱们的扫尾证据了MAM-CLIC4在心肌细胞保护HR毁伤中的平直作用。
总而言之，咱们的扫尾建议了一个新的Cl?通谈CLIC4，在MAM中起着退换ER/SR线粒体Ca的基本作用二+内稳态(图6).此外，咱们的磋商扫尾强调了MAM-CLIC4通过退换线粒体膜电位和氧化应激退换缺氧/缺血再肃肃毁伤后心肌毁伤和心功能的空前作用(图6).因此，咱们揣测MAM-CLIC4在介导内质网线粒体通信中的作用也会影响其他生理和病理生理经过。
图6MAM-CLIC4对内质网线粒体Ca有伏击作用二+通过退换线粒体功能，在腹黑保护中起重要作用。在稽查器中大开材料和方法通盘在老鼠身上进行的举止都是根据好意思国国立卫生磋商院进行的实验动物的照顾和使用指南并得到俄亥俄州立大学动物照顾委员会的批准。所磋商于东谈主体腹黑的实验都是在俄亥俄州立大学机构审查委员会的批准下进行的。公布的数据、方法和无突变小鼠将被提供给其他磋商东谈主员，认识是复制扫尾或复制举止。
细胞系HEK 293T细胞在含有1×谷氨酰胺、葡萄糖（4.5 g/L）、1 mM丙酮酸钠、碳酸氢钠（1.5 g/L）、10%（v/v）胎牛血清（FBS）和青霉素（100 IU）/链霉素（100μg/ml）的Dulbecco校阅Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在湿化5%（v/v）CO中培养237°C培养箱，每3天传代一次。
克隆截断客户4用“快换”法定点突变法取得克隆。咱们用过pCDNA3.1-clic4系列将N终局标志编码为模板。简言之，使用捎带位点特异性突变以引入谷氨酰胺-67和半胱氨酸-189的阻隔密码子的正义和反义引物（表S1）来扩增构建物客户4Δ问题67和客户4Δ189元差异是。根据制造商的决议制备响应搀杂物，其中含有200 ngpcDNA3.1客户端4质粒扩增20个周期。扩增响应搀杂物用Dpn1型酶在37°C下过夜。在含有α-氨基比林的琼脂培养皿上，在含有α-氨基比林的琼脂培养基上，在温度为100°C的培养基上进行培养，移动时分为5小时。用Sanger测序法筛选阳性菌落。
HEK细胞转染HEK细胞以15000个细胞的密度接种在涂有聚乙烯的玻璃盖玻片（0.13mm厚）上-d-赖氨酸和培养过夜。一朝细胞达到70%的交融率，他们被转染200ng的Flag标志pCDNA-CLIC4，pCDNA-CLIC4Δ问题67，和pCDNA-CLIC4Δ189元差异按照制造商的阐发使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）。转染16小时后，用200纳米有丝分裂追踪器在37°C下加载10分钟，清洗，并进行免疫细胞化学惩办。
小鼠成年/重生心肌细胞及线粒体的分离成体心肌细胞用简化的无Langendorff法分离小鼠成年心肌细胞(54)来自wt和客户4?/?老鼠。浅易地说，老鼠被麻醉，大开胸腔败露腹黑。割断降主动脉，然后打针7 ml EDTA缓冲液[130 mM NaCl，5 mM KCl，0.5 mM NaH2东谈主事军官410 mM Hepes，10 mM葡萄糖，10 mM丁二酮肟（BDM），10 mM牛磺酸和5 mM EDTA（pH7.8）]干预右心室。夹闭升主动脉，将腹黑移动到含有EDTA缓冲液的培养皿中。左心室打针10ml EDTA缓冲液，然后注入3ml肃肃缓冲液[130mmnacl，5mmkcl，0.5mmNaH2东谈主事军官4，10 mM Hepes，10 mM葡萄糖，10 mM BDM，10 mM牛磺酸和1 mM MgCl2（pH7.8）]，30 ml胶原酶溶液[胶原酶2（0.5 mg/ml）、胶原酶4（0.5 mg/ml）和在肃肃缓冲液中制备的卵白酶XIV（0.05 mg/ml）]。心腔被分开，轻轻地拉成1毫米的碎屑。用和睦研磨法分离细胞，用5ml住手缓冲液[含5%（v/v）无菌FBS的肃肃缓冲液]遏制胶原酶活性。用灌流缓冲液冲洗细胞三次，使其在重力作用下千里降。然后在4℃下用200 nM有丝分裂追踪器加载心肌细胞1小时。然后将捎带有丝分裂追踪器的心肌细胞分散在多聚体上-我-赖氨酸惩办盖玻片1小时，并进行免疫细胞化学惩办。
小鼠重生心肌细胞如前所述，分离出MNCMs(19，55)来自wt和客户4?/?老鼠。浅易地说，从wt小鼠的p3幼崽中手术切除腹黑，并将其置于分离缓冲液中[16mmnacl，20mmhepes，0.8mmna2HPO公司4，5.4 mM葡萄糖，5.4 mM KCl和0.8 mM MgSO4（pH7.35）]。心室在分离缓冲液中离散，然后在1000℃离心g在4°C下保握5分钟。将组织块再行悬浮在含有0.25%胰卵白酶的分离缓冲液中，并在37℃下在水浴摇床中培养20分钟以进行消化。20分钟后，细胞被旋转下来（1000g，5min，4°C），通过细胞过滤器（100μm）汇注上清液平分离的乳鼠心肌细胞，独立即用20%（v/v）马血清富集。将剩余的组织颗粒消化至少两次或直到不雅察到清亮的组织颗粒。然后将分离的心肌细胞接种于明胶[0.1%（w/v）]–包被的盖玻片上，并在含有20%（v/v）FBS和青霉素（100 IU）/链霉素（100μg/ml）的DMEM中培养，在5%（v/v）的湿化CO中培养2培养箱温度37℃，培养2天后更换培养基。分离第4天后，在37℃下用200nm有丝分裂追踪器加载MNCMs 10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，并进行免疫标志。
粗线粒体分量，clic1?/?，和客户4?/?分离小鼠（12至15周）的腹黑，并将其细碎并均匀化于分离缓冲液A【70 mM蔗糖、210 mM甘霖醇、10 mM EDTA Na2，和50 mM tris HCl（pH 7.4）]，使用波特-埃尔维耶姆均质机（七冲程）。匀浆于1300时离心g在4°C下保握5分钟。将上清液移动到崭新的Eppendorf试管中，并在10000下离心g在4°C下保握10分钟。将含有粗线粒体的颗粒再行悬浮在含有200 nM有丝分裂追踪器的拒绝缓冲液A中，并在4℃下培养1小时。有丝分裂追踪器的线粒体分散在一个多聚体上-我-赖氨酸惩办的盖玻片在4°C下惩办1小时。然后惩办线粒体进行免疫标志。
超纯线粒体的分离如前所述，分离超纯线粒体组分(11).浅易地说，小鼠腹黑（12至15周）在拒绝缓冲液a（70 mM蔗糖，210 mM甘霖醇，10 mM EDTA Na）中均质后2，在1300下离心50 mM tris-HCl（pH 7.4）]g在4°C下保握5分钟。上清液在10000时再次离心g在4°C下保握10分钟。将含有粗线粒体的颗粒再行悬浮在55μl的分离缓冲液A中。将再行悬浮的粗线粒体制剂笼罩在缓冲液B（250 mM蔗糖、10 mM Hepes Na和1 mM EDTA Na）中制备的3 ml 30%（v/v）Percoll上2（pH值7.4）]。样品在50000下离心g在4°C下保握45分钟。超速离心后，取得三个透明层，差异标志为M1、M2和M3，其中M3是超纯线粒体部分。仔细分离M1、M2和M3层，在1mL缓冲液A中再行悬浮，并在12000下离心g在4°C下保握10分钟（三次）。在放射免疫千里淀现实（RIPA）缓冲液中再行悬浮颗粒[50 mM tris HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA Na21毫米4，1%（v/v）NP-40，0.5%（w/v）脱氧胆酸钠，0.1%（w/v）十二烷基硫酸钠，1 mM NaF，1 mM苯甲基磺酰氟和1 mM Na三旁白4（pH7.4）含有卵白酶遏制剂（1片/50 ml，罗氏）和磷酸酶遏制剂（1片/10 ml，罗氏）]，在液氮中冷冻，并惩办用于卵白质印迹分析。
MAMs和线粒体的分离MAM组分被分离出来，正如之前发表的那样(10，56).浅易地说，使用波特-埃尔维耶姆均质机（8次冲程）将小鼠腹黑（12至15周）分离、离散并均匀化于IB-H1缓冲液中（225 mM甘霖醇、75 mM蔗糖、0.5%（w/v）牛血结拜卵白（BSA）、0.5 mM EGTA和30 mM tris-HCl（pH 7.4）]。匀浆在740℃离心两次g在4°C下各5分钟。汇注上清液并在9000时再次离心g在4°C下保握10分钟。去除上清液（细胞溶胶），并在冰缓冲液IB-H2（225 mM甘霖醇、75 mM蔗糖、0.5%（w/v）BSA和30 mM tris-HCl（pH 7.4））中轻轻再悬浮，并在10000下离心g在4°C下保握10分钟。去除上清液，将颗粒再行悬浮在缓冲液IB-H3中【225 mM甘霖醇、75 mM蔗糖和30 mM tris HCl（pH 7.4）】，并在10000下再次离心g在4°C下保握10分钟。将含有粗线粒体的颗粒再行悬浮在55μl的线粒体再悬浮缓冲液（MRB）[250mm甘霖醇，0.mm5egta，5mmhepes（ph7.4）]。将粗线粒体颗粒笼罩在3 ml 30%（v/v）Percoll培养基中制备的Percoll[225 mM甘霖醇、1 mM EGTA和25 mM Hepes（ph7.4）]，并在95000下离心g在4°C下保握30分钟。这一步将MAM（上带）和线粒体（下带）分开。汇注含有线粒体的下带，在MRB缓冲液中再行悬浮，并在10000℃离心g在4°C下保握10分钟。离心后得到的小球在RIPA缓冲液中再悬浮并在液氮中冷冻。在MRB缓冲液中稀释含有MAM的上带，并在10000下进一步离心g在4°C下保握10分钟。汇注上清液并在100000下离心g在4°C下保握1.5小时。汇注MAM颗粒，在RIPA缓冲液中再行悬浮，并在液氮中冷冻。通盘细胞组分包括粗腹黑裂解物、胞浆、粗线粒体、纯化线粒体和MAM组分，经过三次反复的冻融轮回，并进行westernblot分析。
G-cepiaer成像用G-cepiaer病毒感染和培养MNCMs(15)在玻璃盖玻片上。48～72小时后，用含有2毫米钙的蒂罗德溶液肃肃CMs二+用488nm的氩激光引发生物传感器G-CEPIA1er，在500～550nm处采集荧光辐照十-是的400 Hz采样率下的现象。心肌细胞表露于SERCa2a遏制剂thapsigargin（10μM）2min后，用共焦显微镜不雅察荧光信号。用G-CEPIA1er的衰减时分常数手脚SR泄漏的度量，将荧光数据拟合成单指数函数(57).SR Ca二+大剂量咖啡因（10毫米）应用于钙内，使储存量减少二+-免费的泰罗德溶液。
mtRCamp1h成像评估mito-Ca二+惩办后，MNCMs感染mtRCamp1h病毒(16)在玻璃盖玻片上培养48至72小时。用543nm的HeNe激光引发mtRCamp1h生物传感器，在560～660nm波长边界内采集荧光辐照，测量了荧光辐照波长十-是的现象和400 Hz采样率。心肌细胞灌流蒂罗德溶液（2毫米Ca二+).子群客户4?/?记载前用Ru360（1μM）预培养MNCMs 10分钟。记载5min后，用Ca冲洗CMs二+-用皂甙[0.001%（v/v）]浸透前的游离酪胺溶液。用含有细胞任意素D（10μM）和Ca的里面记载溶液代替该溶液二+缓冲EGTA（2 mM）以取得最小mtRCamp1h荧光。Ca的加入使荧光强度达到最大值二+（20μM）。使用方程式
[加利福尼亚州二+]米=Kd× (F–F最小)/(F最大值–F)
其中离解常数(Kd)mtRCamp1h=1.3μM时，荧光移动为[Ca二+]米关于每个MNCM。
胞浆和线粒体Ca二+在乳鼠心肌细胞中在玻璃盖玻片上感染了mtRCamp1h病毒(16).48～72小时后，感染的MNCMs在室温下用Fluo-3am（Invitrogen）在含有2mmca的Tyrode's溶液中抛弃10min二+，然后在含有2 mM Ca的Tyrode's溶液中清洗10分钟二+心肌细胞灌流含有2 mM Ca的Tyrode's溶液二+在RT录制时期。用543nm的HeNe激光引发生物传感器mtRCamp1h，在560-660nm波所长汇注荧光辐照，在488nm引发Fluo-3am，在500-530nm波长汇注荧光辐照。咖啡因在10mm处率领RyR2介导的Ca二+开释。加利福尼亚州二+瞬态振幅示意为ΔF/F0，其中F0是基本荧光和ΔF=F?F0.
加利福尼亚州二+成年小鼠心肌细胞的影像学磋商胞浆Ca的共焦成像二+如前所述(17)简而言之，崭新成年小鼠心肌细胞(54)在室温下将Fluo-3am（Invitrogen）装入含有1mm Ca的Tyrode溶液中10min二+，然后在含有2 mM Ca的Tyrode's溶液中清洗10分钟二+心肌细胞灌流含有2 mM Ca的Tyrode's溶液二+在RT录制时期。Fluo-3am在488nm引发，荧光辐照在500-530nm波长，在200hz的线扫描现象下汇注。心肌细胞的起搏频率为0.5hz。β肾上腺素能应允剂ISO在100nm处使用。实验实当前，咖啡因在10毫米处被用于评估SR-Ca二+本色。胞质钙二+瞬态振幅和咖啡因瞬态振幅示意为ΔF/F0，其中F0是基本荧光和ΔF=F?F0SERCa2a率是通过拟合咖啡因率领的钙的单指数来策画的二+瞬时的，然后用双组分指数拟合胞浆Ca二+具有固定第一τ的瞬态。
97自拍超频在线心肌细胞Fura-2AM染色浅易地说，新分离的心肌细胞用钙二+(54)再悬浮于心肌细胞培养基[M199，含5%BSA，BDM（1mol/ml）和1×青霉素/链霉素]。关于钙测量，成年心肌细胞装载Fura-2AM（0.5μM）(20)数据采集前20分钟。数据汇注使用一个联络到Motic AE31显微镜上的IonOptix系统（IonOptix），在40×物镜上自满，并在1 Hz下用20 V刺激。细胞内钙的变化二+使用Fura-2双引发（340/380nm）单辐照（510nm）比率成像监测水平。在基线和ISO诊疗（100 nM）后进行测量。
Langendorff腹黑肃肃诊疗离体IR毁伤Wt CD1和客户4?/?如前所述，从室内饲养取得的小鼠（12至15周）进行Langendorff灌流(12).浅易地说，从老鼠身上切下腹黑，并将其置于冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）（118 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM KH）中2东谈主事军官4，1.2毫米MgSO425毫米NaHCO三11.1毫米d-葡萄糖和2 mM CaCl2).主动脉插管，腹黑在Langendorff安装上逆行肃肃，KHB以95%O起泡2–5%一氧化碳2腹黑肃肃15分钟，然后缺血25分钟，在37°C下再肃肃2小时。关于假对照组，腹黑在37℃握续肃肃160分钟。在某些情况下，腹黑在再肃肃前用DMSO（载体对照）或IAA-94（50μM）后惩办10分钟。为了评估大肠癌，腹黑缺血25分钟，再肃肃20分钟。再肃肃后，对腹黑进行惩办以评估线粒体大肠癌或用TTC染色以评估梗死面积。
体内IR毁伤与持久结扎用经典方法和前文所述的率领心肌IR毁伤的新方法对小鼠进行IR毁伤(23).结扎LCA 40min，再肃肃24h。不使用呼吸机时，手术时分在2min内完成。浅易地说，在左胸作念了一个小的皮肤切口，然后作念了一个荷包缝合。剖解后，胸小肌松开，涌现第四肋间谬误。在第四肋间作念了一个小切口，腹黑被轻轻地“弹出”。缝合左冠状动脉降支，并用6-0丝线在距左冠状动脉开端2-3毫米处系上一条缝条。结扎后，腹黑被放回胸腔内，在肌肉和皮肤闭合之前，东谈主工排出空气。缝合线的内针端被剪短，缝合线的另一端保握在胸外，长0.8厘米。缺血40分钟后，轻轻、稳固地拉动缝合线的长端，开释滑膜，使腹黑再肃肃。经典的体内IR毁伤方法是用3%（v/v）异氟醚麻醉小鼠，用20号静脉导管插管，用O2和2%（v/v）异氟醚。剖解后，冠状动脉的缝合姿色与非经典的IR毁伤方法相似。缺血40min握续通气，切口用盐水浸泡纱布笼罩。缺血期实现后，松解后关闭胸腔。假手术组行一样的手术，但不阻断LCA。在基础水暖和再肃肃24小时后对小鼠进行超声心动图成像。关于慢性心肌缺血毁伤，不进行再肃肃，而是连气儿结扎8周。
伊文念念蓝/TTC染色在活体IR毁伤的情况下，再肃肃24小时后，麻醉小鼠，大开胸腔，通过先前的结扎再行结扎LCA周围的韧带。主动脉打针2%（w/v）伊文念念蓝染料20μl。腹黑被速即切除，冷冻，切片成垂直于腹黑长轴的厚切片。未染色部分被界说为AAR。切片在室温下用1%TTC（PBS制备）孵育15min，用4%（w/v）多聚甲醛（PFA）固定5min，用徕卡S9i成像。心肌梗死面积（惨白）用ImageJ量化，用AAR上梗死面积的百分比示意。AAR策画为AAR占左心室总面积的百分比。离体缺血再肃肃毁伤后的腹黑进行冷冻和TTC染色，策画梗死面积。
超声心动图高频、高分辨率超声成像系统用于超声心动图（Vevo 2100和Vevo 3100成像系统，FUJIFILM VisualSonics Inc.，多伦多，加拿大）。用于wt和客户4?/?使用了一个高频传感器探头（VisualSonics MS400，频率边界18至38 MHz，VisualSonics MX550D，频率边界25至55 MHz，FUJIFILM VisualSonics Inc.，多伦多）使用。浅易地说，用1.5-2%（v/v）的异氟醚和O搀杂麻醉小鼠2心率守护在每分钟400～450次之间。沿胸骨旁长轴地点采集M、B型图像，测量心功能。使用Vevo LAB 3.1.1分析软件分析图像。
免疫印迹分析在MAM和超纯线粒体制备经过中取得的不同细胞组分在RIPA缓冲液中再行悬浮，在4℃下连气儿回荡培养1小时。来自wt和客户4?/?将IR毁伤后边际区的小鼠或腹黑切片在RIPA缓冲液中离散，匀浆制备腹黑裂解液。在液氮中快速冷冻裂解物，一朝解冻，在4℃下培养，并握续摇晃1小时。1小时后，样品在12000下离心g在4℃下20 min，汇注上清液并将其加载到4至20%（w/v）的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并移动到硝化纤维素膜上。卵白质载量用胭脂红S染色证据。用LI-COR闭塞缓冲液闭塞膜，并用tris缓冲盐水（TBS）冲洗，然后在4°C下与多样主要抗体孵育过夜。使用的主要抗体有GRP78/BIP（ab21685）、CLIC4（sc-135739）、CLIC1（sc-374202）、三磷酸腺苷（ATP）合酶（ab14748）、MCU（14997）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（2118）、丝裂霉素2（ab-205236）、ACSL4（PA5-27137）、遏制素（ab-10198）、细胞色素c（pa1-12250）和亲环素D（AP1035）。在用TTBS（含有0.05%吐温-20的20 mM Tris缓冲液盐水）洗涤三次10分钟后，在室温下用与IR680/IR800结合的抗兔/小鼠次级抗体培养1小时，然后用TTBS再次洗涤3次5分钟。使用红外荧光系统（Bio-Rad）不雅察信号。专揽ImageJ对条带的强度进行量化，并专揽不同亚细胞组分的丽春红S信号将其归一化为负载卵白。在某些情况下，卵白质地尺度化为相应的GAPDH对照。
HR毁伤重生心肌细胞缺氧6h，复氧毁伤12h。在35 mm玻璃底培养皿或涂有0.1%（w/v）明胶的盖玻片中培养重生心肌细胞4天后，将细胞置于37°C的模块化湿化缺氧室（Biospherix，C127）和1%（v/v）O2，5%（v/v）一氧化碳2，均衡N2在不含葡萄糖和FBS的DMEM中抛弃6小时。缺氧后，细胞在含葡萄糖（4g/l）和20%（v/v）FBS的DMEM中再行交融，培养12小时。再肃肃后的细胞进行JC1染色以评估膜电位，2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）检测ROS，TUNEL法检测细胞示寂。图像分析领受ImageJ。
免疫标志分离的粗线粒体、成东谈主或重生儿心肌细胞、HEK转染细胞和给与常氧/小时毁伤的乳鼠心肌细胞，如前一节所述，用4%（w/v）PFA固定10分钟(12).然后，用0.5%（v/v）tritonx-100使粗线粒体、心肌细胞和HEK细胞浸透10min，然后用10%平淡山羊血清（NGS）阻断30min。然后将样品与多样特异性低级抗体[在含有1%（w/v）NGS和0.1%（v/v）tritonx-100的PBS中稀释]在4℃下培养过夜。与主要抗体GRP78/BIP（ab21685）、CLIC4（sc-135739）、CLIC1（sc-374202）、ATP合酶（ab14748）、丝裂霉素2（ab-205236）、ACSL4（PA5-27137）、不容卵白（ab-10198）和细胞色素c（pa1-12250）孵育后，样品用含有0.1%（v/v）Triton X-100的PBS洗涤（三次），并与抗鼠/兔Alexa Fluor 488（2μg/ml）和抗兔/小鼠ATTO647N（1μg/ml）的二级抗体在RT下孵育1小时，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（核标志：1:10000），安装有Mowiol 4-88或Extended Gold（分子探针）。细胞用尼康A1R高分辨率共焦显微镜和中值滤波成像(8).专揽ImageJ策画共定位指数的百分比。
ROS测量使用氯甲基22′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H2DCFDA）（生命时期，C26827）测量ROS生成。再肃肃后的重生心肌细胞用DCFDA（10μM）在无酚红的惯例DMEM中染色30min，染色后用不含酚红的DMEM洗涤细胞，用Nikon A1R共焦显微镜在485/535nm的引发和辐照波长下成像。常氧情状下的细胞被用作对照，并进行访佛的惩办。荧光强度用ImageJ定量。ROS产生相干于常氧的倍数变化用条形图示意。
标志法HR毁伤后或平淡氧（对照组）的重生心肌细胞用4%（w/v）PFA固定10分钟，用0.25%（v/v）Triton X-100浸透20分钟，并按照制造商的阐发（Thermo Fisher Scientific）使用TUNEL检测试剂盒进行TUNEL染色。用DAPI复染染色细胞核。用Nikon-A1R共焦显微镜，引发辐照波长差异为488和530nm，取得荧光图像。
钙保握智力来自wt和客户4?/?小鼠在PBS中洗涤，切碎，并在缓冲液A（70 mM蔗糖、210 mM甘霖醇、1 mM EDTA和50 mM tris HCl（pH 7.4））中使用Potter-Elvehjem均质器（七次冲程）使其均质。匀浆在2500下离心g5分钟。汇注上清液并在12000下离心g将含有粗线粒体的颗粒再悬浮于55μl缓冲液B中[70 mM蔗糖、210 mM甘霖醇、0.1 mM EDTA和50 mM tris HCl（pH 7.4）]。用荧光分光光度计（日立F-2710或Hitachi F-7100）检测线粒体外钙。在存在或不存在CsA的情况下，将钙绿-5N，六钾盐（2.5μM）（Thermo Fisher Scientific，从500μM储备中提真金不怕火10μl）添加到CRC缓冲液中[150 mM蔗糖，50 mM KCl，2 mM KH2东谈主事军官4，5 mM琥珀酸和20 mM tris-HCl（pH 7.4）]，并测量荧光（500 nm引发和530 nm辐照）。30s后，加入50μl分离的线粒体样品。再过90秒，而后每隔60秒，5μM CaCl2脉冲被加入，直到荧光快速增多标明线粒体示寂。根据制造商的阐发，使用Bio-Rad试剂盒对线粒体进行卵白质估算。荧光值根据卵白质浓度尺度化，并比较不同实验组率领线粒体示寂所需的钙。
JC1染色评价线粒体膜电位牺牲用JC1染料对平淡和HR毁伤条目下的重生心肌细胞进行染色(33)在加湿5%（v/v）CO中，在37°C下保握30分钟2培养箱。然后用不含酚红的DMEM清洗细胞，并用尼康A1R共焦显微镜成像。JC1染料是线粒体膜电位的一个认识。在较高的线粒体膜电位下，JC1染料聚集在线粒体中，变成红色的J1聚集体，在590nm处辐照。在较低的膜电位下，JC1染料保握绿色单体体式，在530nm处辐照。红色和绿色荧光强度的比值决定了线粒体膜电位的变化。
小鼠和东谈主腹黑切片的免疫组化磋商东谈主和小鼠组织切片在二甲苯中脱石蜡，用酒精和PBS复水，然后使用柠檬酸盐缓冲液（Vector Laboratories，#H-3300-250）提真金不怕火抗原。不对格的东谈主体腹黑组织在取得机构审查委员会批准和知情同意后取得，非衰败腹黑组织是与俄亥俄州生命线器官采购技俩合营采购的。切片在室温下以3%（v/v）H孵育2O2遏制内源性过氧化物酶活性10min，用PBS中5%（w/v）NGS阻断1h。用小麦胚芽（wgs）培养1～5min，每片用含小麦胚芽的wgs培养1～5min。用PBS冲洗三次后，用抗CLIC4、抗遏制素和抗细胞色素c抗体在4℃下培养过夜。一级抗体孵育后，用含PBS的0.1%（v/v）tritonx-100清洗切片，然后用次级抗体孵育。二次抗体培养后，用DAPI（1:10000稀释液）冲洗和染色，然后用Mowiol 4-88或Extended Gold（分子探针）安装。细胞用尼康A1R高分辨率共焦显微镜和中值滤波成像(8).
东谈主腹黑组织亚组分如前所述，冷冻东谈主腹黑组织被亚组分(32).浅易地说，150 mg组织在细胞熔化缓冲液（CLB）缓冲液中均匀化[10 mM Hepes，10 mM NaCl，1 mM KH2东谈主事军官45毫米NaHCO三，5毫米EDTA，1毫米氯化钙20.5毫米氯化镁2（pH7.5）和皆备卵白酶遏制剂片]，而且通过添加100μl 2.5 M蔗糖来收复等渗性。匀浆在6300离心g在4°C下保握10分钟。将上清液移动到崭新管（sup1）中，将颗粒再行悬浮在500μl CLB/0.25 M蔗糖中，并在6300再行离心g在4°C下保握5分钟。将上清液（sup2）与之前的上清液样品（sup1）搀杂，并将颗粒再行悬浮在1 ml TSE缓冲液中【10 mM tris、300 mM蔗糖、1 mM EDTA和0.1%（v/v）NP-40（pH 7.5）】中并均质化（30次冲程）。样品在4000℃离心g在4°C下保握5分钟。用TSE缓冲液均质后得到的最终颗粒再悬浮在RIPA缓冲液中，代表浓缩的核部分。搀杂上清液（sup1和sup2）在107000下离心g在贝克曼超离神思中，在4°C下保握30分钟。离心智商后取得的上清液代表细胞溶质分数。超速离心后得到的颗粒再悬浮在RIPA缓冲液中，代表膜和细胞器部分。对裂解物进行Western blotting惩办，并用抗CLIC1和抗CLIC4抗体进行探伤。CLIC4和CLIC1的抒发尺度化为通过丽春红S染色检测的总卵白含量，使用ImageJ软件分析定量条带强度。