哺乳动物精子发生是一个高度复杂且受到严实调控的细胞发育过程。该过程包含三个最基本的生物学事件：有丝分裂、减数分裂和精子形成。在有丝分裂过程中，精原细胞履历自我更新、增殖和分化，保证了精子发生的握续性和自如性；在减数分裂过程中，发生同源染色体的精确配对、重组交换与精确分离，在保证遗传自如性的基础上产生了配子遗传物资的高度种种性；在精子形成过程中，则发生了顶体形成、组卵白-鱼精卵白转变、核浓缩和包装重建等一系列复杂的细胞生物学和形态学变化，使精子细胞具备了率领和受精潜能。上述过程中生精湛胞类型的种种性和生物学事件的高度复杂性决定了精子发生是商议基因抒发调控的绝佳模子。
经过数十年的真切商议，面前对哺乳动物精子发生的商议仍然存在着很多制约成分。举例，面前尚未有高效和约略的生精湛胞体外培养体系，况且由于数十类生精湛胞和多种体细胞同期存在于睾丸组织当中，要获取高纯度且处于特定发育阶段的各级生精湛胞是极其侵略的。因此，现时对精子发盼愿制的商议多选用的是对类型搀杂的群体细胞的系综平均商议，而非对单个性细胞径直进行系统商议。这就导致永久以来咱们对哺乳动物精子发生的调控机制败落一个系统全面的勾通。
2018年7月30日，国外着名学术期刊Cell Research在线发表北京大学生命科学学院汤富酬教讲课题组与中国科学院生归天学与细胞生物学商议所童明汉商议员课题组、李劲松商议员课题组调和的题为“Single-cell RNA-seq Uncovers Dynamic Processes and Critical Regulators in Mouse Spermatogenesis”的最新商议后果。这项责任创始性地将精子发生同步化能力与生殖细胞特异性荧光标记相集结，分离获取了高纯度的处于不同发育阶段的小鼠生精湛胞，并应用高精度单细胞转录组测序的能力，诞生了小鼠精子发生过程的转录组精湛图谱。该责任系统揭示了精子发生过程中基因抒发调控的动态变化，筛选、考证了不同发育阶段的枢纽调控因子，说明了不同发育阶段精子细胞与卵细胞集结后产生的胚胎具有不同的发育潜能，并系统追想了精子发生过程中RNA可变剪接的动态变化、减数分裂性染色体失活（MSCI）等多种枢纽生物学事件的核心限定。
一、精子发生同步化能力取得高纯度各级生精湛胞的策略
精子发生是一个连气儿且非同步化的过程，阐明为生精上皮的细胞组合存在周期性变化，沿生精小管纵轴标的的不同位置处于不同的生精上皮周期。睾丸内生精湛胞类型的复杂性则源于生精上皮周期性开释的维甲酸信号——维甲酸为精原细胞分化的必需因子，精原细胞分化的不同步酿成了不同生精上皮内生殖细胞组合的种种性。
基于精原细胞分化的机理，该商议通过对更生小鼠连气儿七天饲喂维甲酸合成通路的防止剂WIN 18，446，使精子发生断绝于未分化型精原细胞阶段，在第八天通过腹腔打针维甲酸，使精原细胞同步分化。由于分化后的细胞周期相对固定且同步，通过对维甲酸惩办不同时分点的小鼠系列取材，可取得不同发育阶段的生精湛胞。而未分化型精原细胞不受同步化的影响，为了幸免其混浊，该商议构建了生精湛胞特异性捎带红色荧光卵白（Vasa-dTomato）的基因敲入小鼠模子和未分化型精原细胞特异性捎带黄色荧光卵白（Lin28-YFP）的基因敲入小鼠模子。红色单阳性的细胞即为同步化的见地细胞，不错通过单细胞采集系统Unipick取得单个细胞或FACS分选收罗见地细胞群体。基于上述能力，该商议分离并果决了20类处于精子发生不同期期的细胞类型（图1），并运用高精度单细胞转录组测序的能力诞生了上述不同发育阶段的转录组详备图谱。
图1 商议过程暗意图及该商议中20种生精湛胞类型
二、生精湛胞转录组的动态变化
通过对20个阶段的1，204个生精湛胞进行高精度单细胞转录组测序，经过严格的质地狂妄，剩余1，136个细胞用于后续分析。基因抒发数量扫尾判辨，在统统这个词精子发生过程中，生精湛胞需要调动基因组近90%（20，088个基因中的18，037个）的卵白质编码基因的抒发（图2a）；与此同期，各阶段生精湛胞转录水平存在显著的动态变化。其中晚粗线期与双线期精母细胞达到统统这个词精子发生过程的转录峰值，而在晚细线前期与细线期阶段则为转录低谷期（图2a）。聚类扫尾判辨，20类生精湛胞不错诀别为七大类。理由理由的是，同处于DNA复制的早细线前期与中晚期细线前期，精母细胞被聚类到不同类群之中（C1与C2）（图2b），领导早细线前期（ePL）向中晚期细线前期（mPL）的回荡可能是减数分裂过程潜在的垂危蜿蜒点；同为圆形精子细胞的RS2（C5）、RS4与RS6（C6）和RS8（C7）则被分为三群，领导其功能可能存在权贵各别。
图2 （a）箱式图展示了20个阶段的生精湛胞中已知卵白质编码基因的基因数量；（b）t-SNE分析将生精湛胞诀别为C1至C7共七个新类群
三、精子发生过程核心纽调控因子的筛选与考证
参与减数分裂过程的新基因
减数分裂是生殖细胞所特有的生物学事件，是生物有性生殖的基础。在此过程中，同源染色体的非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换，从而使配子呈现遗传种种化，加多了后代的适应性。如斯复杂的生物学过程需要开阔因子的共同调和，而在此之前已知的调控因子并不全面，有待进一步挖掘和叙述。
该商议通过系统的生物信息学分析发现与减数分裂重组过程干系的垂危基因，包括Prdm9、Gm960、Meiob等，它们均特异抒发于细线期或偶线期精母细胞内。与此同期，还发现了一些未知基因，包括Fbxo47、Pparg、Ccnb3等也阐明出相通的抒发模式，领导这些未知基因可能在减数分裂重组过程中阐明枢纽调控作用。
该商议采用Fbxo47基因开展进一步的功能考证，此前的报谈觉得Fbxo47基因和东谈主类癌症干系，但是其具体功能已经未知。该商议构建了Fbxo47的条款性基因敲除小鼠，功能商议发现生精湛胞内特异性失活Fbxo47基因的小鼠阐明为雄性不育。睾丸切片H&E染色扫尾判辨，Fbxo47基因敲除的成年小鼠的精子发生断绝于生精上皮的第Ⅳ期，同期发生大都精母细胞凋一火的陶然（图3a）。免疫荧光染色扫尾进一步判辨，Fbxo47基因敲除的成年小鼠生精上皮内莫得粗线期精母细胞及后续细胞类型，阐明为减数分裂前期I停滞（图3b）。上述扫尾进一步说明该商议诞生的精子发生过程转录组精湛图谱在筛选参与特定生物学事件的潜在调控因子的可靠性。
图3 （a）8周龄野生型小鼠睾丸和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的H&E染色扫尾；（b）8周龄野生型小鼠和Fbxo47基因敲除小鼠睾丸切片的免疫荧光染色扫尾。标尺：50 μm
精子发生过程中垂危的转录因子
精子发生过程具有很强的阶段特异性，在不同阶段有着不同的转录特征，而转录因子被觉得在精子发生过程中调理了基因抒发的时空特异性。
为了寻找调控精子发生枢纽回荡节点的转录因子，该商议分别分析了有丝分裂向减数分裂回荡过程和减数分裂向精子形成回荡过程中的转录因子共抒发调控集会。共抒发集会扫尾判辨，c-fos/c-jun和Zfp316在有丝分裂向减数分裂回荡过程中具有潜在的调控作用（图4a）。而在减数分裂向精子形成回荡过程中，除已报谈的在生精湛胞发育过程中阐明着垂危功能的Crem和Rfx2外，该商议还筛选出像Sox30和Zfp541这么未知的潜在转录因子（图4b）。
图4 有丝分裂向减数分裂回荡（a）及减数分裂向精子形成回荡（b）过程中的转录因子共抒发调控集会。其中，黄色圆点浮现各个转录因子，连线浮现转录因子之间的关联
为了考证这些未知转录因子的作用，该商议对小鼠进行了Sox30基因的全局性敲除或生殖细胞特异性敲除。功能商议发现无论是全局性敲除的小鼠照旧条款性敲除的小鼠，都阐明为雄性不育。组织学H&E染色发现，Sox30基因敲除小鼠的精子发生阐明为精子形成艰辛，生精上皮内莫得长形精子，少许的圆形精子细胞会聚形成多核巨型细胞。通过对顶体的染色，发现Sox30基因敲除小鼠的精子发生断绝于圆形精子形成的第3~4步，领导Sox30基因在调控精子形成中的枢纽作用（图5a）。
为了探究Sox30调控精子的形成机制，商议东谈主员从Sox30条款性基因敲除小鼠中获取了49个第三步圆形精子细胞用于单细胞转录组分析。Sox30基因敲除组和野生型对照组细胞内基因抒发各别显著，存在2000多个各别抒发基因（1，153个突变组下调基因和895个突变组上调基因）。通过对各别抒发基因的GO分析发现，Sox30基因敲除组下调的基因与精子形成密切干系。为了进一步寻找受Sox30径直调控的下流靶基因，该商议开展了SOX30的ChIP-seq执行。通过与RNA-Seq的扫尾共同分析，在基因敲除组下调的基因中找到233个受Sox30径直调控的枢纽靶基因。通过GO分析发现，这些靶基因与精子形成密切干系，举例Chd5、Hils1和Sun5等（图5b）。
图5 Sox30基因敲除阻截了小鼠精子细胞的发育：（a）8周龄条款性敲除小鼠（Sox30-cKO）和对照组小鼠（control）的睾丸组织切片H&E染色与荧光染色扫尾，其中PNA标志精子细胞的顶体；（b）野生型、条款性敲除、全局性敲除小鼠在三个代表性基因上ChIP-seq的扫尾。比例：50 μm
四、第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子受精产生的胚胎具有较低的发育潜能
基于该商议诞生的各级生精湛胞的高精度转录组数据，商议东谈主员筛选获取了特异性抒发于不同发育阶段圆形精子的名义标志物，包括Cd37、Cd63、Cd96和Cd177等（图6a）。流式细胞分选实考说明了CD63阴性省略奏效地富集第7~8步的晚期圆形精子细胞；而CD63强阳性则能富集第1~2步的早期圆形精子细胞。这一执行扫尾提供了一种运用名义标志物分离获取不同发育阶段圆形精子细胞的策略。
为了不雅察不同发育阶段的圆形精子细胞是否与其授精后胚胎发育潜颖慧系，该商议进一步通过同步化能力及名义标志物分选的能力分别获取了早期圆形精子细胞和晚期圆形精子细胞，应用胞质圆形精子打针（Intracytoplasmic Round Spermatid Injection，ROSI）实考说明了晚期圆形精子细胞打针所得胚胎发育至囊胚的比率权贵高于早期圆形精子细胞打针所得胚胎（图6b）。因此，第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子与卵细胞集结后产生的胚胎具有较低的发育潜能；领导了东谈主类临床上和动物执行中ROSI奏服从较低很可能是由于使用的圆形精子细胞中很大一部分是早期圆形精子而导致的。若是省略使用上述新发现的名义标志物将晚期圆形精子特异性富集出来用于ROSI，有可能大幅度普及其奏服从。
图6 第1~2步圆形精子相较于第7~8步圆形精子具有较低的胚胎发育潜能
五、 精子发生过程中可变剪接的动态变化
在精子发生过程中存在着大都的可变剪赴任件。该商议通过对来自精子发生13个枢纽阶段的66个单细胞进行全长RNA-seq测序，扫尾发现可变事件在各阶段生精湛胞内的漫衍情况与基因抒发数见地动态变化极为相似，领导了可变剪接伴跟着转录过程，是精子发生过程中转录后调控的垂危阐明情势（图7a）。同期，该商议还发面前各个阶段的生精湛胞中，内含子淹留（intron retention）和外显子最初（exon-exon junction）类型的可变剪赴任件永久是占比最高的可变剪接类型。
图7 （a）柱状图展示了不同精子发生阶段中，每个细胞中至少含有两种可变事件的基因平均数量；（b）堆积柱状图展示了相邻阶段各别基因和可变变化之间的关系
为了商议在相邻阶段之间发生变化的可变剪赴任件，该商议将每个阶段的单细胞归拢在一都，再行谋略每个阶段的可变剪接情况。扫尾发现，若是仅接洽两个阶段中至少有一个阶段存在可变剪接的情况，不错显著看到内含子保留是占比最高的可变剪接变化，这也就领导内含子保留可能是参与生精湛胞转录后调控的垂危妙技之一。
为了不雅察可变剪接和基因抒发之间的具体关系，该商议分析了相邻阶段之间各别基因的可变剪接变化。扫尾发现，当生精湛胞从前一个阶段过渡到下一个阶段时，上调的各别基因更倾向于保留内含子而防止抒发，此时对应的RNA就会先储存起来而不进行卵白质翻译。关联词，下调的各别基因则更多的回荡为剪接老练的转录本，这么的行径成心于普通翻译使用（图7b）。
六、性染色体基因抒发的动态变化
在精子发生过程中，性染色体上的基因有其特有的抒发花样，即发生减数分裂性染色体千里默（Meiotic Sex Chromosome Inactivation，MSCI）陶然。由于受细胞纯度问题困扰，对该陶然的勾通相配发盼愿制的商议一直不够真切。
该商议通过详备比拟不同发育阶段生精湛胞内性染色体基因抒发的水平，详备归纳了不同基因的抒发情况，并将这些基因诀别红MSCI PMSC、MSCI escape PMSC、escape MSCI等（图8a）。其中PMSC（Post Meiotic Sex Chromosome Inactivation）指的是减数分裂后性染色体干系基因不激活情状，已有的不雅念觉得，性染色体上的基因在完成减数分裂后，仍旧处于转录防止情状，此种陶然称之为PMSC。同期，该商议发现不同性染色体基因的不同抒发模式与其功能密切干系，举例escape MSCI的基因功能与染色质的重塑密切干系，领导这些基因可能参与了精子形成过程（图8b）。
图8 （a）热图展示了MSCI-PMSC、MSCI-逃跑PMSC、逃跑MSCI、RS特异性等五种类型性染色体上的基因在精子发生过程中的抒发变化；（b）逃跑MSCI基因的GO富集分析扫尾
综上，该责任通过将精子发生同步化时刻与单细胞转录组测序时刻玄妙地集结起来，绘图了一幅高精度的小鼠精子发生转录组图谱，全面揭示了小鼠精子发生过程中基因抒发的高度动态性与时空特异性，并在此基础上对发现的枢纽候选基因通过基因敲除和径直下流靶基因检测（ChIP-seq）等策略进行真切的功能和机理商议，为后续全面商议精子发生调控机制提供了表面基础和肃穆资源，并对临床男性生殖艰辛的诊疗提供了表面指导，为最终叙述哺乳动物精子发生的分子调控机制提供了可能路线。
北京大学北京将来基因会诊高精尖改换中心博士生郑宇轩和高云、中国科学院生归天学与细胞生物学商议所博士后陈瑶、博士生林震和杨苏明为该著述的并排第一作家，汤富酬、童明汉和李劲松为该著述的共同通信作家。此项责任得到中国科学院政策性先导科技专项、科技部（973磋议）、国度要点研发磋议、上海生科院基金、国度当然科学基金、上海市科委、北京将来基因会诊高精尖改换中心的撑握。
剪辑：麦洛